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氨基酸色谱(氨基酸分析仪 柱前衍生化)

admin123 肥料资讯 1个月前 (08-18) 阅读(13) 评论(0)

氨基酸色谱

柱前衍生化试剂

1.产品名称

具有柱前衍生的漾林氨基酸分析仪

2. 目的

分析仪可以使用自动进样器混合分析氨基酸作为OPA试剂的柱前衍生物。分析仪可以使用自动进样器混合分析氨基酸作为OPA试剂的柱前衍生物。它还能够检测氨基酸水解的存在,例如在蛋白质,胶原蛋白,肽和加工食品中发现的氨基酸。

3. 分析原理

1) 氨基酸定义

氨基酸是一种包含一个氨基(NH2)与一个羧基(COOH)跟其他变量基团用R符号代替,R基团可以是氢原子一样(甘氨酸),或者R-基团可以是具有各种官能团的碳骨架。氨基酸的分子基本结构式:

氨基酸分析仪 柱前衍生化

氨基酸基本结构式: R-CH(NH2)-COOH

17根据氨基酸的结构特点,可以看到氨基酸包含三个基团:氨基基团,羧基基团,以及侧链基团。值得注意的是,具有基本结构式的有22种必须氨基酸,其中17中为一类氨基酸,5种为二类氨基酸。

氨基酸

氨基酸是构成蛋白质的基础分子,它们首先形成肽或多肽的短聚合物链,然后组合在一起形成蛋白质。 二十种氨基酸由标准遗传密码编码,通常称为标准氨基酸。 人体产生更复杂的氨基酸,称为非标准氨基酸。

已经确定二十二个氨基酸对生物系统很重要-甘氨酸,丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,苏氨酸,丝氨酸,半胱氨酸,半胱氨酸,组氨酸,蛋氨酸,天冬氨酸,天冬酰胺,谷氨酸,2-酪氨酸,赖氨酸,精氨酸,苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸,脯氨酸和氧脯氨酸。必需氨基酸是人体不能通过化学反应从其他化合物合成的氨基酸。在人类中,必需氨基酸包括赖氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,蛋氨酸,苯丙氨酸,苏氨酸,色氨酸,缬氨酸,以及儿童具有的组氨酸和精氨酸。

检测氨基酸

(1)由于存在三种芳香族氨基酸(色氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸),紫外(UV)分光光度法很容易定量蛋白质,但是这类氨基酸在蛋白质中只占很小一部分。其他19种氨基酸是非芳香族的,不能用紫外分光光度法检测。这就需要构建那19个氨基酸的衍生物,让其可以通过UV / VIS分光光度法检测和定量,这种方法可间接检测和定量这19种氨基酸。

(2) 构建氨基酸衍生物的试剂

– 茚三酮

– OPA(邻苯二甲醛)

– PITC(异硫氰酸苯酯)

– FMOC(芴基甲氧基羰基氯)

2) 柱前衍生化

l OPA 方法

该方法利用OPA试剂构建氨基酸衍生物,该衍生物易于通过UV / VIS分光光度法检测和测量。 OPA试剂与游离氨基酸反应,进而游离氨基酸可以通过柱中的阳离子交换而分离。氨基酸衍生物在室温下以与茚三酮法不同的方式构建。 异吲哚在紫外光下发出荧光,当第一个氨基酸与OPA试剂和硫脲反应时产生,就可以通过UV / VIS荧光方法检测氨基酸。

氨基酸分析仪 柱前衍生化

使用OPA试剂的反应过程

4. 分析方法

1) 样品制备

a. 确定样品量(例如:将200毫克酱油放入样品瓶中)

b. 向小瓶中加入30ml 6N HCl。将样品在130℃保温24小时以水解氨基酸。

c. 通过加入50ml纯净水稀释水解的样品。

d. 取1ml样品,装入2ml进样瓶中。

e. 干燥后, 将1ml硼酸盐缓冲液(或0.02N HCl)加入小瓶中并摇动。

f. 用0.2um的注射器过滤器过滤样品。

2) 分析条件

a. 自动进样器混合条件:

氨基酸分析仪 柱前衍生化

泵 : 渐变流速: 2ml/min

氨基酸分析仪 柱前衍生化

紫外/可见光检测器: 338nm

色谱柱 : C18( 4.6mm 150mm, 5um)

b. 自动进样器混合条件:

氨基酸分析仪 柱前衍生化

泵 : 渐变流速: 1.2ml/min

氨基酸分析仪 柱前衍生化

紫外/可见光检测器r : 338nm

色谱柱 : C18 (4.6mm 150mm, 3.5um)

5. 分析器配置

(1) YL9150 自动进样器

(2) 四元泵,YL9110

(3) 4通道真空脱气机, YL9101

(4) 柱室, YL9131

(5) 紫外/可见光检测器或荧光检测器, YL9120

(6) 数据系统(YL-Clarity 软件 or Autochro-3000)

(7) OPA试剂盒

(8) HPLC 执行组件 (安装套件)

(9) 脱溶剂套件

(10) 注射器过滤器0.2um

6. 色谱图

[17 kinds of Amino acids standard, with C18 column 4.6x150mm, 5um]

1.天冬氨酸2.谷氨酸3.丝氨酸4.组氨酸5.甘氨酸6.苏氨酸7.精氨酸8.丙氨酸9.酪氨酸10.胱氨酸11.缬氨酸12.蛋氨酸13.色氨酸14.苯丙氨酸15.异亮氨酸 16.亮氨酸17.赖氨酸

氨基酸分析仪 柱前衍生化

[17 kinds of Amino acids standard, C18 4.6x150mm, 3.5um]

氨基酸分析仪 柱前衍生化

7. 应用

· 生命科学:蛋白质结构,合成肽鉴定

· 制药:注射用药,营养药物

· 食品和饮料中必需氨基酸的测量

· 临床:诊断氨基酸水平和缺陷

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