回答一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长，会导致非特异性吸附，增加洗涤的难度，最终因洗涤不彻底而出现非特性显色。

　　一、一抗孵育时间，不能超过多久

　　1、一抗的定义

　　一抗指的是能够和非抗体性抗原（特异性抗原）特异性结合的蛋白，也就是平常所说的抗体。二抗指的是能和抗体结合的抗体，主要用于检测抗体的存在，放大一抗的信号。

　　2、一抗的孵育时间

　　（1）一抗的孵育时间与温度，抗体浓度有关。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。

　　（2）如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长，会导致非特异性吸附，增加洗涤的难度，最终因洗涤不彻底而出现非特性显色。

　　二、双抗体夹心法检测未知抗原

　　1、包被

　　用0.05M碳酸盐包被缓冲液（ph9.6）对抗体进行稀释，直至蛋白质含量为1-10μg/ml为止。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。第二天的时候，去掉孔内溶液，然后用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

　　2、加样

　　将0.1ml经过稀释的待检样品放到反应孔中，在37℃的环境条件下孵育1小时，然后进行洗涤。

　　3、加酶标抗体

　　在各个反应孔中，加入0.1ml新鲜稀释的酶标抗体，在37℃的环境条件下，孵育0.5-1小时，然后进行洗涤。

　　4、加底物液显色

　　在各个反应孔中，加入0.1mlTMB底物溶液（应当临时配制），37℃的环境条件下10-30分钟。

　　5、终止反应

　　在各个反应孔孔中，加入0.05ml的2M硫酸。

　　6、结果测试

　　（1）在白色背景下，用肉眼进行观察即可。反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。

　　（2）在ELISA检测仪上，于450nm（若以AS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，如果大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。