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一抗孵育时间,不能超过多久

admin123 肥料资讯 11个月前 (03-16) 阅读(34) 评论(0)

  一抗孵育时间,不能超过多久

  回答一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。一般情况下,在37℃的条件下,孵育1-2小时左右。在室温的条件下,孵育3小时左右。在4℃的条件下,孵育18-24小时左右。如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长,会导致非特异性吸附,增加洗涤的难度,最终因洗涤不彻底而出现非特性显色。

  一、一抗孵育时间,不能超过多久

  1、一抗的定义

  一抗指的是能够和非抗体性抗原(特异性抗原)特异性结合的蛋白,也就是平常所说的抗体。二抗指的是能和抗体结合的抗体,主要用于检测抗体的存在,放大一抗的信号。

  2、一抗的孵育时间

  (1)一抗的孵育时间与温度,抗体浓度有关。一般情况下,在37℃的条件下,孵育1-2小时左右。在室温的条件下,孵育3小时左右。在4℃的条件下,孵育18-24小时左右。

  (2)如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长,会导致非特异性吸附,增加洗涤的难度,最终因洗涤不彻底而出现非特性显色。

  二、双抗体夹心法检测未知抗原

  1、包被

  用0.05M碳酸盐包被缓冲液(ph9.6)对抗体进行稀释,直至蛋白质含量为1-10μg/ml为止。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。第二天的时候,去掉孔内溶液,然后用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。

  2、加样

  将0.1ml经过稀释的待检样品放到反应孔中,在37℃的环境条件下孵育1小时,然后进行洗涤。

  3、加酶标抗体

  在各个反应孔中,加入0.1ml新鲜稀释的酶标抗体,在37℃的环境条件下,孵育0.5-1小时,然后进行洗涤。

  4、加底物液显色

  在各个反应孔中,加入0.1mlTMB底物溶液(应当临时配制),37℃的环境条件下10-30分钟。

  5、终止反应

  在各个反应孔孔中,加入0.05ml的2M硫酸。

  6、结果测试

  (1)在白色背景下,用肉眼进行观察即可。反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅。

  (2)在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O·D值,如果大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。

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